组织工程肝移植将提供可移植器官的可持续来源。利用猪肝支架构建再内皮化、再血管化的肝脏，并使其具有持续性体内在大型动物模型中进行灌注。
肝移植仍然是治疗终末期肝病的唯一有效方法。由于全国每年只有6000个供肝可用，需求远远超过供应。以细胞为基础的创新疗法，如肝组织工程，为补充有限的优质器官供移植提供了替代方案。
从6-10 kg猪获取的全肝进行快速灌注脱细胞，形成具有完整血管网络和包膜的无细胞支架。支架用来源于人或猪脐静脉的人或猪内皮细胞（HUVEC或PUVEC细胞）重新内皮化在生理灌注压力下，将PUVEC种子移植物作为辅助性肝移植植入受体猪体内。
非内皮化移植物灌注后30分钟出现血栓形成，无血管流入。72小时后，再内皮化移植物显示未见血管流入，肉眼无血栓，移植后门静脉造影未见门静脉血流体内血液灌流。组织学检查显示移植后有存活的内皮细胞。
再次内皮化的猪全肝移植获得血管通畅体内在没有全身抗凝治疗的情况下。这种可植入的生物工程再内皮化肝脏为未来无限来源的患者特异性肝移植概念提供了早期证据。
终末期肝病(ESLD)为8th美国最常见的死因，约4万人死亡;全球范围内的影响更大，仅中国就有38.3万人死亡[1.]．ESLD对处于人生经济高峰时期(45-64岁)的成年人影响最大，据估计，仅在美国，ESLD每年的直接成本就超过100亿美元，每年住院人数达186,000人[2.]．目前治疗ESLD的唯一方法是肝移植。不幸的是，肝移植的成功带来了最大的挑战，可移植器官的短缺。在美国，大约有16000名患者在等待肝移植，但这些患者中只有大约6000人每年能从肝移植中受益。肝组织工程为移植提供了一种无限供应相容器官的独特潜力。
器官获取的替代策略已经进行了试验，包括异种移植和细胞移植。由于免疫排斥和移植物血栓形成，异种器官的应用受到限制。肝细胞移植是全器官移植的另一种选择;然而，细胞供应、细胞质量和移植不良的限制，特别是在肝硬化条件下，限制了以细胞为基础的治疗的临床疗效。全器官组织工程的使用克服了这些移植障碍，并提供了无限供应可移植器官的潜力。
全肝组织工程利用支架或细胞外基质(ECM)，允许在天然器官结构背景下患者特异性细胞材料的生长和扩张[3.]猪去细胞器官基质的使用保留了天然ECM蛋白质和生长因子，允许细胞以自然形态附着和增殖[4.]．已经证明了ECM的存在，以支持细胞培素和趋化性，直接细胞分化和支持细胞重塑[5].在报告灌注脱细胞之前，脱细胞组织仅限于相对较薄的样本（小肠粘膜下层、膀胱、皮肤等）[6]．相比之下，全器官灌注去细胞化已经实现了一种全器官去细胞化的形式，它保留了自身的三维结构、机械特性、结构和血管网络[7,8]．结果是一种理想的肝特异性支架，可以植入患者特异性内皮细胞、肝细胞、胆管细胞或祖细胞。这将允许针对接受者的可移植器官工程，从而避免免疫抑制的需要[9]．组织工程可移植肝脏的一个关键步骤是建立一个有功能的血管系统，能够在吻合后进行长期灌注。如果没有合适的血管内皮衬里，在没有抗凝的情况下，移植物持续的血液灌注很快会导致血栓形成。在这项研究中，我们报告了一种去细胞猪肝移植的内皮播种方法和在血液灌流条件下的评估体内条件。选用幼猪肝脏是因为其解剖结构与人肝脏相似。采用同种异体(猪)脐带来源的内皮细胞在体外进行移植。这些细胞在移植物内提供了血管结构和肝窦的单层覆盖，以降低血栓形成的风险。在没有进行慢性抗凝治疗的情况下，我们观察到受体动物在60分钟后没有移植物血栓形成的证据，并在72小时的研究终点观察到有限血栓形成。
本研究严格按照国家健康研究院实验室动物的照顾和使用指南中的建议进行。所有动物护理都按照Mayo Clinic Institional Mathine Paral和使用委员会标准进行。该具体研究是在协议A58912和A49315的协议下获得批准的。所有动物都被梅奥诊所的比较医学部门的研究人员和畜牧业员工安抚，喂养，照顾，安乐死。
从中西部猪回收屠宰场获得的10公斤供体猪，在死后立即收获供体肝脏。动物被镇静和安乐死通过研究人员心脏内直接注射戊巴比妥钠。安乐死后立即进行中线剖腹手术。门静脉分离，用10根法国导管插管。肝脏进行了原位灌注1L冷冻磷酸盐缓冲盐水。缝合结扎肝动脉和总胆管。解剖肝下和肝上下腔静脉，以留出足够的长度进行移植后插管。移植肝脏，进一步灌注1L磷酸盐缓冲盐水，并在4℃下保存。
移植的肝脏在整个脱细胞过程中以12毫米汞柱连续灌注。用0.6% SDS 4-12升浴对肝脏进行活性脱细胞，持续48小时，然后在无菌水、0.1%过氧乙酸(PAA)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续洗涤。为了降低生物负荷风险，脱细胞过程是在10,000级洁净室中使用无菌技术进行的。猪脐带静脉内皮细胞(PUVECs)的分离只有O型动物的脐部被用来分离内皮细胞。为了分离PUVECs，用4%青霉素链霉素溶液在PBS中洗涤脐部，直到所有可见的红细胞被清除。结扎血管分支，血管腔内充满10000 U型2型胶原酶(Invitrogen)和0.5 g BSA (Sigma)的消化液，悬浮在50 mL的PBS中。37℃孵育15 min。按摩血管以促进细胞释放，离心收集细胞。重复消化，独立培养，分离内皮细胞。 Cells were cultured in complete Endothelial Growth Media (EGM-2, Lonza) and passaged at approximately 90% confluence. Endothelial cells were confirmed by cell surface markers (CD-31, manufacture), LDL uptake, and morphology. Cells were grown up in large lots and cryopreserved for re-endothelialization. Prior to re-endothelialization, cells were placed into culture and allowed to fully recover.
用PUVEC或人脐静脉内皮细胞（HUVEC，Lonza）接种整个脱细胞肝脏。通过肝静脉将整个脱细胞肝脏插管并安装到无菌生物反应器中。生物反应器填充约750 ml EGM-2培养基，在培养过程中以12-14 mmHg持续灌注肝脏；调整蠕动流速以保持持续灌注压力。生物反应器氧合和pO2.监测水平以确认持续氧合。100×106到120×106分离到第8代和第12代之间的PUVECs。将细胞浓缩至5 × 106细胞/ml，注入肝灌注。24-48小时后，肝经门静脉插管，再植入100 × 106到120×106在5×10的通道8和12之间的puvecs6细胞/ ml。施用后，停止灌注30分钟以使初始细胞植入能在12mmHg下连续灌注。在实验期间每天改变500ml培养基，以确保细胞获得适当的营养。对培养基进行代谢分析，以确保血糖留在培养基中（Flex-Nova生物医学）。如果葡萄糖消耗超过15mg / hr，则每天发生800毫升培养基。每日媒体变化，肝脏培养了10-21天。
受体猪被确定为生理健康的30-40kg动物。这些动物接受中线剖腹手术，暴露后腹膜。所有重新内皮化的PUVEC移植物被植入作为辅助肝移植物，通过与左肾静脉端到端吻合流入，通过从左肾静脉端到侧吻合流出onor肝上下腔静脉至受体肝下下腔静脉（见图1，见补充视频）.未行肾切除术;经左肾静脉流入肝移植物。在血管吻合前以150单位/kg的单剂量静脉注射肝素。没有额外的抗凝治疗。
图1:A）肝移植物作为辅助肝移植植入，通过与左肾静脉端到端吻合流入；B）移植前用盐水冲洗内皮化肝脏；C，D）准备移植的受体下腔静脉和左肾静脉。流出通过dono的端到侧吻合完成r肝上下腔静脉至受体肝下下腔静脉；E）灌注受体血液后的肝移植。查看图1
术中使用血管血流探针(FSB-series, Transonic.com)监测流入静脉和流出静脉，评估血管通畅程度。采用二维和多普勒超声(s系列，Sonosite.com)在术中和术后每日评估移植物的通畅。
在研究结束时，研究人员对受体动物实施安乐死，并切除再内皮化的移植物。切除后门静脉置管并行CT血管造影。所有移植物用福尔马林固定，切片后用苏木素和伊红(H&E)进行组织学分析，并用抗血管内皮钙黏蛋白的cd -31抗体进行免疫组化染色。组织学服务由明尼苏达州罗彻斯特市的梅奥核心组织学实验室提供。
12只动物被纳入急性期研究。3只动物接受了未移植内皮细胞(脱细胞)的脱细胞肝移植;这些动物组成了对照组。6只受体动物在急性研究臂进行了再内皮化肝移植物的辅助移植(60分钟移植物植入);在慢性研究组，3只动物接受了再内皮化肝移植物的辅助移植(72小时移植)。
灌注脱细胞通过插管动脉和通过天然血管运行温和的清洁剂溶液，有助于快速进入整个器官。这导致器官从内到外快速脱细胞，如图2A和图2D所示，其中整个猪肝在约24小时内脱细胞病理检查显示脱细胞肝内缺乏细胞材料和细胞核，保留了包括小叶和中央静脉在内的整体结构（图2B和图2E）。免疫组化染色显示缺乏半乳糖基α（1,3）半乳糖（α-半乳糖）灌注脱细胞后（图2C和图2F）。此外，通过Picogreen进行的DNA定量显示，脱细胞后，天然肝脏中的DNA从1477±142 ng DNA/mg组织（平均值±SEM）减少到19.4±2.9 ng DNA/mg组织。
图2:灌注去细胞化允许通过天然血管系统去细胞化，确保大器官快速去细胞化，同时维持对组织再造至关重要的血管导管。A)离体猪肝和D)灌注脱细胞猪肝，含完整的血管和器官包膜。马森的三色的染色;B)灌注去细胞化前和E)灌注去细胞化后显示细胞物质的缺乏和固有结构的保留，包括小叶内(*)中央静脉。半乳糖- α(1,3)半乳糖(α - gal)免疫组化染色;C)灌注去细胞化前和F)灌注去细胞化后显示高浓度的α - gal与细胞物质相关，灌注去细胞化后基质中检测不到它。查看图2
整个脱细胞型肝脏被安装到生物反应器中，并在培养过程中连续灌注12-14 mmHg（图3）。在重新内皮化期间，Huvec种子肝脏被密切监测活力。葡萄糖消耗量在10-14培养周期内增加了相似的动力学（图3）并用作非破坏性分析工具，以确定何时何时实现了理想的重新内皮水平。消耗至少10mg葡萄糖/小时的移植物的特征在于H＆E染色，荧光原位杂交和扫描电镜(图3)一致显示内皮化率很高。通过腐蚀铸造和CT血管造影进一步证实了血管通畅(图4)。裸基质主要在移植物的内侧部分进行对比，但未能在毛细血管水平实现灌注。相比之下，HUVECS或PUVECs内皮化的基质在毛细血管水平上显示出均匀的造影剂填充。HUVEC种子基质与PUVEC种子移植物相比，覆盖度和动力学都有所提高。然而，HUVEC种子移植物并没有在猪模型中进行功能评估。
图3:A)灌注脱细胞的全肝，有门静脉和肝静脉的管状植入;B)生物反应器系统，其中肝脏持续灌注内皮细胞并播撒内皮细胞;C)脱细胞肝移植物在装载内皮细胞前的苏木精和伊红染色;D) 14天HUVEC再内皮化肝移植的苏木精和伊红染色显示大致的肝结构;E)荧光原位杂交显示肝脏完全再内皮化;F)苏木精和伊红染色表示再内皮化肝移植物中的单层内皮细胞(见黑色箭头);G)扫描电镜显示单层扁平的内皮细胞;H) HUVECs移植肝的葡萄糖消耗率(mg葡萄糖/小时)表征。查看图3
图4:通过铸型(A和B行)和CT血管造影(C行)证实了毛细血管水平的完全内皮化。非内皮化移植物的造影剂主要集中在中央实质内，最小造影剂到达外小叶。HUVEC和PUVEC种子移植物均显示在大部分移植物中灌注改善，造影剂池化最小。查看图4
研究对照组（脱细胞移植物）的所有动物在再灌注后30分钟内使移植物血栓形成。这些动物立即被安乐死。相比之下，急性和慢性研究组中所有使用PUVEC种子移植物的动物在研究期结束时均显示移植物血流通畅，门静脉流入和肝静脉流出吻合口的血流量为35-40ml/min。在急性研究中，三只动物出现了术中出血并发症，而研究人员开发了外科植入技术。其中两个术中并发症是包膜撕裂，导致移植包膜出血。完成吻合时，用湿润的无菌纱布包裹移植物，以防止意外损伤，从而克服包膜撕裂。第三只动物的冠状静脉出血不受控制，在供体肝切除术时未发现，因此在再内皮化之前未得到控制。
所有进行慢性(72小时)灌注研究的动物均被允许从全身麻醉中恢复并恢复正常活动。这些动物没有表现出肝移植的不良后果。每天用多普勒超声监测同种异体肝移植的灌注，以确认其通畅。
在移植时，所有急性肝移植物都进行了门静脉造影，以确认血管通畅(图5)。非内皮化移植物显示造影剂外溢和肝血管结构丢失。相比之下，内皮化的移植物显示正常的血管结构到毛细血管水平，没有造影剂外渗。72小时后，经多普勒超声和门静脉造影证实血管通畅和血流灌注，内皮化移植物保持通畅(图6)。内皮细胞通过H&E和CD-31染色(图6)显示血管内壁有内皮细胞，由于移植物内没有肝细胞，红细胞定位于实质间隙。
图5:A)急性移植肝移植物;B)非内皮化肝移植物静脉造影显示灌注有限，对比明显渗漏;C)内皮化肝移植，在急性移植后显示整体灌注和持续的毛细血管床溶解。查看图5
图6：在体内血液灌注3天后移植物的图像。a）多普勒超声证明了门静脉流入和植入后72小时的门静脉流入和下腔静脉（流出）的通畅;b）72小时的静脉注射移植物，通过灌注床的可视化确认超声数据;C，D）通过H＆E染色的组织学检查证明了与RBCs的薄壁肽填充，可能导致整体灌注减少。然而，大型灌注床仍然存在于72小时，证明保持连续血液灌注的能力，并允许在未来的移植物中添加肝细胞;E，F）通过CD31（Dako - JC70A克隆）的组织学检查（Dako - JC70A克隆）染色在连续血液灌浆后的血管结构在72小时后显示内皮细胞覆盖率。面板C和E是高功率（棒= 300微米）。面板D和F是低功率（条= 1 mm）。查看图6
72小时后，患者因严重腹痛、持续发热和身体不适而再次入院。用800个白细胞、10 g/dl血红蛋白、235000个血小板和保存的肾功能（肌酐1.0 mg/dl）进行实验室检测。更新CT扫描，发现一个骨盆肿瘤与5×8×6 cm的肾移植物相邻，动脉期增强，确定肾移植物动脉瘤的诊断，该动脉瘤累及右侧髂外动脉（图2和图3）。
肝移植领域的进展使其成为ESLD的非常成功的待遇，但受转移捐赠器官的稀缺的限制：每年只有38％的美国候补患者的38％将获得肝脏。对于未来20年的预计未经预测的移植器官的需求[10，等待移植的需求和可供移植的器官之间的差距只会越来越大。因此，人们开始设想传统全器官肝移植的替代范式，包括可移植肝的组织工程。
组织工程不仅提供了一个绕过可移植器官缺陷的机会，而且可以预见，它也为传统的全器官移植提供了一些优势。例如，通过干细胞技术用自体细胞重新植入移植物的可能性消除了免疫抑制的需要，并且增加了实际脱细胞支架的免疫原性也进行了研究，表明同种异体或异种移植都不会增加免疫反应[11]．
几个组，包括我们的团体已经成功地产生了大规模的器官脚手架，尽管基于SDS的全器灌注脱细胞化技术[11,12]．这种方法保留了细胞移植和功能所需的必要ECM蛋白，同时保留了器官本身的血管结构，可以与受体循环吻合[13]，因此优于其他技术，如将肝组织片植入带血管的皮下腔[14].由于功能正常的原代肝细胞的高需氧量及其对缺血性损伤的易感性，保存肝脏中的天然血管和微血管网络尤为重要[15]．
组织工程的主要挑战是可移植肝脏正在开发一种血管系统，其充分刺穿移植物，没有血栓形成。这有限公司在将全肝脏脚手架移植到几个小时的时间有限[16]．抗凝与术后出血并发症有关，而另一种令人鼓舞的替代方法是用内皮细胞或再内皮化在支架的血管床上播种。如果达到100%的覆盖率，并且避免了血细胞和支架中暴露的胶原蛋白之间的接触，理论上应该可以防止血栓形成[17]．该策略已经在生物工程肾移植物中进行了测试，具有前景的结果[18]．其他方法，例如逐层渐变肝矩阵肝素化，没有产生成功的结果[19]．
目前的研究提出了一种在大型动物模型中组织工程可移植肝脏的新方法。它代表了第一个大型动物研究的再内皮化肝基质显示血管开放后72小时植入不使用慢性抗凝。以前的植入尝试使用的是不能直接转化为人类应用的啮齿动物模型[20.，依赖于慢性抗凝，或实现时间较短体内移植物存活时间。Ko等人利用CD-31抗体的固定来重新内皮化肝脏，最终导致内皮细胞在非血管结构内粘附，从而改变ECM。这些再内皮化的肝脏在肾切除术后通过门静脉与肾动脉吻合移植到猪模型中[21]。这不适合临床应用，因为它需要肾切除，肝门静脉系统中动脉流动的长期后果尚不清楚。即使如此，这项研究也只能证明24小时的通畅性。此外，在这项研究中没有提到抗凝，尽管他们以前在肾支架上的工作涉及水杨酸和氯吡格雷的使用[22]．我们的术后研究表明，辅助肝移植术后72小时血流灌注后，肝脏结构得以保留，并通过左肾静脉端到端吻合流入肝脏。
我们已经证明，猪脐带来源的内皮细胞(PUVECs)再内皮化可以在H&E和SEM上形成单层，在门静脉造影上能够在体内血管灌注到毛细血管水平。我们假设这将提供足够的氧气和营养输送，以支持肝细胞的播种和发育。
本研究为大型动物肝移植的发展奠定了基础。我们正在进行的工作旨在优化肝细胞播种和胆道重建。我们假设，在完全重新内皮化的肝血管系统下，移植物将能够为功能正常的肝细胞提供强烈的氧合需要。
总之，这项研究代表了一种新的大型动物模型，组织工程肝能够在大型动物受体中持续灌注。本研究将为未来移植肝细胞和肝实质细胞奠定基础。
我们感谢Scott Thompson医学博士和Gregory Michalak（罗切斯特梅奥诊所）的影像学支持和罗切斯特梅奥诊所核心组织学实验室。
补充视频:肝脏移植。