Thalis 112 EC是一种用于贝宁棉花种植的二元杀虫剂(苯甲酸阿维菌素48 g/L，对乙酰脒64 g/L)的商品名。这些化合物会对居住在暴露区域的居民产生广泛的副作用。本研究旨在评价长期接触该农药对加里皮鼠免疫状态的影响。因此，300只平均体重为30.0±2.64g的gariepinus幼鱼在玻璃水族馆中暴露于亚致死浓度的Thalis (T0 = 0.0;T1 = 0.03;T2 = 0.06;T3 = 0.12;T4 = 0.25和T5 = 0.49 ppm)保存28天。饲养密度为每个装满25升试验溶液的鱼缸14条鱼。测试在半静态系统中进行，每48小时更新50%的测试溶液。研究表明，Thalis的存在导致C. gariepinus白细胞增加。 As for Total immunoglobulin, the presence of a low concentration (T1) of the pesticide leads to an increase followed by a decrease as the concentration increases. However, Thalis did not induce a significant effect on PCV, Hb and Erythrocyte constants (MCV, MCH and MCHC), even though Hb and these Erythrocyte constants showed an increasing trend. The RBC also showed an increasing trend. This haematological profile obtained with C. gariepinus exposed to Thalis is probably linked to the binarity of this toxin made up of molecules from various families whose modes of action are different. It is concluded that indiscriminate use of such pesticides poses a noxious threat to non-target organisms, harm the ecosystems and jeopardizes human health.
泰利斯112 EC，慢性作用，血液学，加里匹氏克拉霉素
在当前的农业实践状态下，传统棉花是主要在贝宁生产的棉花，受到公共当局的持续关注[1-5]。生物棉多年来仍处于试验阶段，仅占全国产量的0.6%。传统的棉花生产包括使用矿物肥料进行土壤施肥，使用化学农药进行杂草控制和植物检疫处理[7]。因此，为了实现籽棉高产和皮棉优质的双重目标，杀虫剂在贝宁[1]棉花种植的技术路线中占有重要地位。这些杀虫剂用作二元杀螨剂或杀蚜剂[3-5,7]。靶标害虫的抗药性不断增强，从而导致药效迅速丧失，这导致了这种控制策略[8]的大量使用。至少有六种方法可以对抗这些棉花害虫。第一次在播种后第50天进行，两次处理必须间隔14天。自2016-2017年棉花运动以来，贝宁北部最大的棉花盆地使用的二元杀虫剂包括Thalis 112 EC、Vizir C 92 EC、Pyrinex Quick 212 EC、Pyro FTE 472 EC等[9]。Thalis是一种以苯甲酸阿维菌素(48 g/L)和对乙酰脒(64 g/L)为基础的杀虫剂，主要用于第一和第二窗口杀灭叮吸虫和第一代食果蛾Helicoverpa armigera[2]。 In view of the volume of this toxicant used in cotton fields, this insecticide currently occupies a place of choice. Several studies had already revealed that, in the Benin cotton basin, the doses of pesticides recommended for the treatment of crops are not necessarily those practiced by farmers [1,10]. These growers increase the recommended amounts of pesticides at will [1]. All these chemical molecules released into the environment seep into the ground or run off and reach aquatic ecosystems as their final receptacle [11], thus making the species that live there vulnerable. Until recently, the adverse effects of pesticides and their residues on non-target organisms have not been seriously considered in Benin. This situation is worrying, especially with the phenomenon of climate change where the toxicity of several chemical pollutants is increasing as a result of global warming [7].
阿维菌素苯甲酸酯属于阿维菌素家族[12]。gariepinus幼体对伊维菌素高度敏感，静态条件下的LC50为15 μg/L[13]。研究发现，阿维菌素苯甲酸改变了Labeo rohita[14]、Oreochromis niloticus[15]和C. gariepinus[13]的血液因子。对乙酰脒是第一代新烟碱家族[16]的一个分子。O. niloticus[8]和C. gariepinus juveniles[17]的96 h LC50分别为182.9 ppm和265.7 ppm。在L. rohita[18]、Cyprinus capio[19]和Cirrhinus mrigala[20]中发现对乙酰氨基酮具有血毒性。
活性物质的单独作用与混合作用不同[8,17]。本研究的总体目标是在当地实验室条件下，确定苯甲酸阿维菌素和对乙酰脒的联合毒性对C. gariepinus血液图谱的影响，C. gariepinus是一个接受来自贝宁北部棉花盆地的杀虫剂和除草剂的水生生态系统的重要物种。这涉及到确定Thalis对C. garariepinus免疫参数的影响。
从贝宁帕拉库(Parakou)相对无污染的渔场(50%为雌性，50%为雄性)采集了300条平均体重为30.0±2.64g的健康淡水鱼。鱼被运送到帕拉库大学水产养殖和水生生态毒理学研究实验室(LaRAEAq)，装在装有充气水的包装良好的聚乙烯袋中。
试验开始前在实验室环境中驯化21 d，每天喂1次2 mm(粗蛋白46%)的商品干饲料GOUESSANT颗粒。鱼缸连接恒曝气系统，12±1:12±1明暗循环。温度保持在26.2 ~ 30.0°C, pH值保持在7.0 ~ 7.8。在此期间，贮存水每隔一天更换一次，以防止腐烂的食物颗粒和废物代谢物的积累。
贝宁棉花产区农民常用的杀虫剂Thalis 112 EC为苯甲酸甲维菌素(48 g/L)和对乙酰氨基酮(64 g/L)，从“农业分配协会”(Societe de Distribution des Intrants)购买。这种二元杀虫剂是粘性的黄色液体。试验溶液是通过直接将产品与脱氯自来水混合获得的，就像在农业环境中所做的那样。所有工作溶液都是在测试前立即制作的。
该实验是根据经合组织指南215进行的，有一些小的调整。根据96 h LC50 = 4.9 ppm(数据尚未发表)的值，选择了5种浓度，即T1 = 0.03 ppm (0.6% 96 h LC50)， T2 = 0.06 ppm (1.2% 96 h LC50)， T3 = 0.12 ppm (2.5% 96 h LC50)， T4 = 0.25 ppm (5% 96 h LC50)和T5 = 0.49 ppm (10% 96 h LC50)进行慢性毒性试验。T0对照组不添加农药。18个水族箱(体积为30 L)用于这6种条件，每个处理3个重复。14条鱼被随机分布在每个装有25L试验溶液的玻璃罐中。试验在半静态条件下进行，每48小时更换50%的试验溶液。试验期间，每天3次用3 mm的人造食物GOUESSANT颗粒(粗蛋白46%)喂养鱼至明显饱腹。暴露时间为28天。鱼缸连接恒曝气系统，12±1:12±1明暗循环。更新试验溶液前后，每48 h记录一次水的pH值、温度等理化参数。为了防止鱼从一个鱼缸跳到另一个鱼缸，鱼缸上都盖了网。 No mortality was observed during this test.
使用1ml一次性注射器从尾静脉采血。取血前先用3%盐溶液处理以减轻应激，然后用丁香油(0.4 ml -1水)麻醉。在每个水族箱6只鱼(3公3母)暴露于Thalis 28天后采集血液样本。采集的血液储存在EDTA小瓶中用于全血细胞计数，1.5 mL eppendorf管用于血清收集。
分析血液学指标如血细胞压积、总免疫球蛋白(IgT)和血图或全血计数。红细胞比容水平是细胞体积(红细胞)和总血量之间的比率，以百分数表示。血球压积(Heamatocrit)的计算方法是将血球样本在3000转/分离心5分钟后获得的全血所占血球长度以厘米为刻度的标尺读取后的数值。红细胞压积也称为填充细胞体积(PCV)。血清中免疫球蛋白的水平通过分光光度法进行评估，之前由Milla等人建立。[21]。蛋白质检测是使用Bradford开发的技术进行的，基于考马斯亮蓝G250在酸性环境中对蛋白质的吸收。总免疫球蛋白的数量是大蛋白沉淀前后血清中蛋白质的数量之差。使用流式细胞仪(SYSMEX XP 300)进行血流造影，结果辅以血涂片。本研究揭示了不同白细胞(嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等)、红细胞总数(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白水平(Hb)和红细胞常数如平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、平均红细胞血红蛋白(MCH)。
实验单元是水族馆。结果以均数±均数标准差表示。在分析数据之前，进行Shapiro-Wilknormality检验，如果正常，则采用ANOVA检验。对于2乘2的平均数比较，Fisher’s LSD检验在STATISTICA软件版本6下使用。P值0.05或小于被认为是显著的。
表1给出了实验中测得的平均温度和pH值。测试解更新前后的数值似乎没有显著差异。排空前温度为27.02 (T4) ~ 27.24℃(T0)，换水后温度为26.97 (T5) ~ 27.18℃(T0)。排空前pH最小值和最大值分别为6.84 (T5)和6.92 (T0)，排空后pH值分别为6.71 (T5)和6.76 (T0和T1)。
血压积(PCV):在本研究中，PCV水平在不同处理和不同性别的暴露期间保持统计学上的相似(p > 0.05)。雌性的这一比率在25.04% (T3)和31.08% (T4)之间波动，雄性的这一比率在32.11% (T4)和36.5% (T2)之间波动(图1)。
总免疫球蛋白(IgT):亚致死浓度的Thalis对C. gariepinus中IgT的影响结果如图2所示。这些结果表明，不同性别的处理之间存在显著差异(p < 0.0001)。与对照组相比，男性T1的IgT增加(T0 = 163.86 mg/mL, T1 = 193.23 mg/mL)，女性(T0 = 148.52 mg/mL, T1 = 178.50 mg/mL)。这些IgT值在T4期男性逐渐下降到84.14 mg/mL，在T4期女性逐渐下降到99.28 mg/mL。
白细胞计数差异:在光学显微镜下(x100物镜)观察到的血液涂片上的不同白细胞如下图3所示。
通过对涂片不同切片的阅读，可以建立鱼的白细胞公式。这些是暴露过程中鱼血液中不同比例的白细胞的平均值±标准差(表2)。暴露过程中记录的淋巴细胞和凝血细胞的水平显示，不同性别的处理之间没有显著差异(p > 0.05)。女性T0最高(96.88%)，男性T5最高(95.84%)。嗜碱性粒细胞水平也无显著差异(p > 0.05)。对照组为0.20%，T4组为0.62%，T5组为0.91%。对于中性粒细胞水平，与对照组相比，某些暴露组呈升高趋势，而其他对照组呈下降趋势。雌性的最小值和最大值分别为1.25% (T3)和2.58% (T1)， 0.83% (T0)。男性分别为0.84% (T5)和2.06% (T2)，对照组为1.95%。嗜酸性粒细胞在各个方向都有变异。女性最低为0.81% (T3)比1.25% (T0)，男性最低为0.79% (T5)比1.18% (T0)。 Concerning the Monoxytes, the trend is an increased in the level of Monocytes in contaminated groups compared to controls in both males and females.
总白细胞计数(WBC):总的来说，观察到白细胞有增加的趋势，男性的T2和两性的T5有显著差异(p = 0.04)。因此，T5的最大值为:雌性为236.43*10^3 /μL，雄性为237.2*10^3 /μL(图4)。
红细胞总数(RBC):红细胞数据的统计分析表明，从一种治疗方案切换到另一种治疗方案时，红细胞计数无显著差异(p > 0.05)。然而，无论性别，T5均有升高的趋势(女性为2.78±0.8*10^6 /μL，男性为2.93±0.5*10^6 /μL)。
血红蛋白含量(Hb):对血红蛋白的方差分析显示，不论性别，均无统计学差异(p = 0.66)。然而，除T4期外，在所有治疗中，男性的血红蛋白水平均逐渐升高。而在女性中，这个值在T4略有增加，但基本保持不变(图6)。
红细胞常数:基于结果(表3)，对红细胞常数(MCV, MCH和MCHC)值的统计分析显示，处理之间无显著差异(p > 0.05)。但各红细胞常数值均有升高的趋势。
实验过程中(更换试验溶液前后)所测得的理化参数(温度和pH值)的变化在统计学上不显著。这意味着这些参数对于测试中的所有处理都是相同的。无论在什么时期，温度都从26.97°C到27.20°C不等。这些值都在C. gariepinus最佳生长推荐的温度范围(26 ~ 30℃)内[22,23]。pH值在6.71到6.92之间变化。这些值与养殖C. gariepinus的推荐范围6.5 - 9一致[22,23]。这些温度和pH值也是Agbohessi等人在同一物种暴露于硫丹和Tihan 175 OTEQ 13个月后得到的温度和pH值，Agbohessi等人[4,5]在棉花杀虫剂Thalis 112 EC和Pyro FTE 472 EC对幼年C. gariepinus的影响中得到的。
鱼类血液学参数已成为评估农药对鱼类[25]影响的不可或缺的工具。Thalis暴露导致C. gariepinus红细胞总计数(RBC)增加，血红蛋白(Hb)含量和血压恒定(PCV)增加，平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)增加。由于MCH和MCHC来自血红蛋白和红细胞，血红蛋白和红细胞滴度的增加会导致MCH和MCHC的增加。血红蛋白和红细胞的增加暗示了鱼类在代谢分解期间增加血液中氧气运输能力的一种策略[26,27]。根据Singh和Srivastava[28]的说法，红细胞升高可能是由于血细胞储备和由于杀虫剂作用导致的血液渗透改变而导致的细胞收缩所致。MCV、MCH和MCHC等红细胞常数似乎是鱼体内平衡系统中较为敏感且可引起可逆变化的变化。据报道，在罗希塔乳杆菌中，由于暴露于二非诺康唑和噻虫嗪[29]，而在性腺巴氏虫中，由于暴露于喹那磷[30]，MCH和MCHC显著增加。据报告，由于溴氰菊酯[31]，斑点中国蝇的MCV显著增加，而由于苯甲磷[30]，角角中国蝇的MCV显著增加。
在本研究中观察到总白细胞计数(WBC)升高。白细胞增多的病理生理条件为白细胞增多[25]。有关WBC的报告显示，在溴氰菊酯[31]的影响下，刺尾锦鲤的WBC值显著增加，在硫磷[32]的影响下，刺尾锦鲤的WBC值显著增加，在单效磷[33]的影响下，刺尾锦鲤的WBC值显著增加，在硫丹和乐果[34]的影响下，刺尾锦鲤的WBC值显著增加，在毒死蜱[35]的影响下，在敌敌畏及其技术级[36]的影响下，刺尾锦鲤的WBC值显著增加。白细胞形成后，要么迁移到关键器官，如脾脏、淋巴结、肠道，要么进入血液。白细胞数量的增加可能是毒性损伤的异常结果。WBC的突然增加可能是由于动物的防御机制和免疫系统的激活。包括杀虫剂在内的几种化合物由于对免疫系统的干扰而产生抗体，这可能是WBC[32]增加的原因。在本研究中，WBC的显著增加可能是由于刺激了鱼的防御机制，以对抗Thalis[37]的影响。白细胞数量的增加是对农药胁迫的一种防御反应。这些变化可能是在杀虫剂存在时激活免疫系统的结果，这反过来可能是鱼的适应性反应，导致更有效的免疫防御[38]。 It is also this reason which explains the rise in the level of Monoxytes in the present study. This response was also observed in the same C. gariepinus exposed to chlorpyrifos and DDforce [39], and in C. carpio after exposure to phenithrotion and dichlorvos [40,41]. This is also in agreement with earlier studies which have observed similar results after exposure of pesticides such as diazinon [42,43], malathion [44], paraquat [45] and curzate [46]. In the present investigation, a fluctuation in the levels of Neutrophil and Eosinophil with an increase in the levels of Basophils while the whole Lymphocytes + Thrombocytes did not vary, was noted. This differential leukocyte count profile obtained in C. gariepinus is surely linked to the binarity of Thalis consisting of two molecules (Emmamectin benzoate and Acetamiprid) whose modes of action are different and which would have neutralized each other. This effect may also be due to the adjuvant contained in this formulation, which is Thalis.
免疫球蛋白是硬骨鱼[47]适应性特异性免疫的最重要成分。这个参数显示了与我们的结果相比的显著差异。T1组的鱼数量增加;这可以解释为适应性免疫反应使鱼T1组的免疫系统具有识别和记忆特定病原体的能力，并通过记忆淋巴细胞产生更强、更快的反应[47,48]。在第一次接触有毒物质后，T1处理的鱼类会产生更强的防御能力。在其他治疗方法中观察到的显著下降可能与它们体内这种毒素的高水平有关。Mohammadalikhani等。[49]也显示了被Captan污染的C. idella的IgT下降。由于高剂量重金属[50]的中毒，一些鱼的免疫活性也有所下降。
本研究清楚地证明了泰利斯112 EC对加里伊氏梭菌血液学生物标志物的不良影响。事实上，即使污染物对C. garariepinus的红细胞压积水平、血红蛋白含量和红细胞常数(MCV、MCH和MCHC)没有显著影响，它也会引起C. garariepinus总白细胞计数的增加。至于总免疫球蛋白，低浓度农药的存在导致先增加后降低的浓度。研究结果表明，这些参数可作为农药对鱼类及其他水生生物毒性的潜在生物标志物，应用于环境生物监测领域。
不适用。
不适用。
不适用。
作者宣称不存在利益冲突。
本研究产生的数据可根据通讯作者的要求获得。
所有作者都同意发表。