Thalis 112 EC是一种用于贝宁棉花种植的二元杀虫剂(苯甲酸阿维菌素48 g/L，对乙酰脒64 g/L)的商品名。这些化合物会对居住在暴露区域的居民产生广泛的副作用。本研究旨在评估长期接触这种农药对免疫状态的影响claria gariepinus．于是，300只幼鸟c . gariepinus(平均体重30.0±2.64g)在玻璃水族箱中暴露于亚致死浓度的Thalis (T0 = 0.0;T1 = 0.03;T2 = 0.06;T3 = 0.12;T4 = 0.25和T5 = 0.49 ppm)保存28天。饲养密度为每个装满25升试验溶液的鱼缸14条鱼。测试在半静态系统中进行，每48小时更新50%的测试溶液。研究表明，塔利斯的存在会导致WBC的增加c . gariepinus．总免疫球蛋白在低浓度(T1)的存在下，随着浓度的增加先增加后减少。然而，Thalis对PCV、Hb和红细胞常数(MCV、MCH和MCHC)没有显著影响，尽管Hb和这些红细胞常数有升高的趋势。RBC也呈现上升趋势。这是血液学的概况c . gariepinus可能与这种毒素的二元性有关，这种毒素由不同科的分子组成，它们的作用模式各不相同。结论是，不分青红皂白地使用这类农药对非目标生物构成有害威胁，损害生态系统并危害人类健康。
泰利斯112 EC，慢性效应，血液学，claria gariepinus
按照目前的农业做法，传统棉花是主要在贝宁生产的棉花，受到公共当局的持续关注[1-5］．生物棉多年来仍处于试验阶段，仅占全国产量的0.6% [6］．传统棉花生产包括使用矿物肥料进行土壤施肥，使用化学农药进行杂草控制和植物检疫处理[7］．因此，为了实现籽棉高产和皮棉优质的双重目标，杀虫剂在贝宁棉花种植的技术路线中占有显著地位[1］．该等杀虫剂用作二元杀螨剂或杀蚜剂[3.-5，7］．目标害虫的抵抗力不断增强，因而药效迅速丧失，这导致了这种控制策略的大量使用[8］．至少有六种方法可以对抗这些棉花害虫。第一次在播种后第50天进行，两次处理必须间隔14天[1］．自2016-2017年棉花运动以来，贝宁北部最大的棉花盆地使用的二元杀虫剂包括Thalis 112 EC、Vizir C 92 EC、Pyrinex Quick 212 EC、Pyro FTE 472 EC等[9］．Thalis，以苯甲酸阿维菌素(48 g/L)和对乙酰脒(64 g/L)为基础，是一种用于第一和第二窗口杀灭叮吸昆虫和第一代食蚊蛾的杀虫双效剂[2］．鉴于棉田中使用这种毒物的数量，目前这种杀虫剂占据了首选的位置。几项研究已经表明，在贝宁棉花盆地，建议用于作物处理的杀虫剂剂量不一定是农民实际使用的剂量[1，10］．这些种植者随意增加农药的推荐用量[1］．所有这些释放到环境中的化学分子都渗透到地下或跑掉，进入水生生态系统，成为它们最后的容器[11，从而使生活在那里的物种变得脆弱。直到最近，贝宁还没有认真考虑农药及其残留物对非目标生物的不利影响。这种情况令人担忧，特别是在气候变化的情况下，由于全球变暖，几种化学污染物的毒性正在增加[7］．
阿维菌素苯甲酸酯属于阿维菌素家族[12］．claria gariepinus幼虫对伊维菌素高度敏感，静态条件下LC50为15 μg/L [13］．研究发现，阿维菌素苯甲酸酯改变了罗氏Labeo rohita的血液因子[14，在Oreochromis niloticus [15),在c . gariepinus［13］．对乙酰脒是第一代新烟碱类化合物的分子[16］．96 h LC50O. niloticus的浓度为182.9 ppm [8和265.7 PPMc . gariepinus青少年(17］．在罗氏乳杆菌中发现对乙酰氨基酮具有血液毒性[18，在塞浦路斯语capio [19和Cirrhinus mrigala [20.］．
活性物质的单独作用与混合作用不同[8，17］．本研究的总体目的是确定，在当地实验室条件下，苯甲酸阿维菌素和对乙酰氨基脒的联合毒性对血谱的影响c . gariepinus它是水生生态系统的一个重要物种，接受来自贝宁北部棉花盆地的杀虫剂和除草剂。这涉及到确定Thalis对免疫参数的影响c . gariepinus．
300条健康的淡水鱼c . gariepinus鱼的平均体重为30.0±2.64g，采集自贝宁帕拉库(Parakou)相对无污染的农用企业综合养殖场(50%为女性，50%为男性)。鱼被运送到帕拉库大学水产养殖和水生生态毒理学研究实验室(LaRAEAq)，装在装有充气水的包装良好的聚乙烯袋中。
试验开始前在实验室环境中驯化21 d，每天喂1次2 mm(粗蛋白46%)的商品干饲料GOUESSANT颗粒。鱼缸连接恒曝气系统，12±1:12±1明暗循环。温度保持在26.2 ~ 30.0°C, pH值保持在7.0 ~ 7.8。在此期间，贮存水每隔一天更换一次，以防止腐烂的食物颗粒和废物代谢物的积累。
贝宁棉花产区农民常用的杀虫剂Thalis 112 EC为苯甲酸甲维菌素(48 g/L)和对乙酰氨基酮(64 g/L)，从“农业分配协会”(Societe de Distribution des Intrants)购买。这种二元杀虫剂是粘性的黄色液体。试验溶液是通过直接将产品与脱氯自来水混合获得的，就像在农业环境中所做的那样。所有工作溶液都是在测试前立即制作的。
该实验是根据经合组织指南215进行的，有一些小的调整。根据96 h LC50 = 4.9 ppm(数据尚未发表)的值，选择了5种浓度，即T1 = 0.03 ppm (0.6% 96 h LC50)， T2 = 0.06 ppm (1.2% 96 h LC50)， T3 = 0.12 ppm (2.5% 96 h LC50)， T4 = 0.25 ppm (5% 96 h LC50)和T5 = 0.49 ppm (10% 96 h LC50)进行慢性毒性试验。T0对照组不添加农药。18个水族箱(体积为30 L)用于这6种条件，每个处理3个重复。14条鱼被随机分布在每个装有25L试验溶液的玻璃罐中。试验在半静态条件下进行，每48小时更换50%的试验溶液。试验期间，每天3次用3 mm的人造食物GOUESSANT颗粒(粗蛋白46%)喂养鱼至明显饱腹。暴露时间为28天。鱼缸连接恒曝气系统，12±1:12±1明暗循环。更新试验溶液前后，每48 h记录一次水的pH值、温度等理化参数。为了防止鱼从一个鱼缸跳到另一个鱼缸，鱼缸上都盖了网。 No mortality was observed during this test.
使用1ml一次性注射器从尾静脉采血。先用3%的盐溶液处理鱼以减轻应激，然后用丁香油(0.4 mLL)麻醉－1指水)在采集血液之前。在每个水族箱6只鱼(3公3母)暴露于Thalis 28天后采集血液样本。采集的血液储存在EDTA小瓶中用于全血细胞计数，1.5 mL eppendorf管用于血清收集。
分析血液学指标如血细胞压积、总免疫球蛋白(IgT)和血图或全血计数。红细胞比容水平是细胞体积(红细胞)和总血量之间的比率，以百分数表示。血球压积(Heamatocrit)的计算方法是将血球样本在3000转/分离心5分钟后获得的全血所占血球长度以厘米为刻度的标尺读取后的数值。红细胞压积也称为填充细胞体积(PCV)。采用分光光度法测定血清中免疫球蛋白的水平，该方法先前由Milla等人建立。[21］．蛋白质检测是使用Bradford开发的技术进行的，基于考马斯亮蓝G250在酸性环境中对蛋白质的吸收。总免疫球蛋白的数量是大蛋白沉淀前后血清中蛋白质的数量之差。使用流式细胞仪(SYSMEX XP 300)进行血流造影，结果辅以血涂片。本研究揭示了不同白细胞(嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等)、红细胞总数(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白水平(Hb)和红细胞常数如平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、平均红细胞血红蛋白(MCH)。
实验单元是水族馆。结果以均数±均数标准差表示。在分析数据之前，进行Shapiro-Wilknormality检验，如果正常，则采用ANOVA检验。对于2乘2的平均数比较，Fisher’s LSD检验在STATISTICA软件版本6下使用。P值0.05或小于被认为是显著的。
表1给出了实验中测得的平均温度和pH值。测试解更新前后的数值似乎没有显著差异。排空前温度为27.02 (T4) ~ 27.24℃(T0)，换水后温度为26.97 (T5) ~ 27.18℃(T0)。排空前pH最小值和最大值分别为6.84 (T5)和6.92 (T0)，排空后pH值分别为6.71 (T5)和6.76 (T0和T1)。
表1:测试溶液的理化质量。查看表1
Heamatocrit (PCV):在本研究中，PCV水平在不同处理和不同性别的暴露期间保持统计学上的相似(p > 0.05)。雌性的这一比率在25.04% (T3)和31.08% (T4)之间波动，雄性的这一比率在32.11% (T4)和36.5% (T2)之间波动(图1)。
图1:claria gariepinus在接触不同浓度的Thalis 112 ECat后进行检测。数据以平均值±标准差表示。查看图1
总免疫球蛋白(IgT):亚致死浓度Thalis对小鼠IgT影响的结果c . gariepinus如图2所示。这些结果表明，不同性别的处理之间存在显著差异(p < 0.0001)。与对照组相比，男性T1的IgT增加(T0 = 163.86 mg/mL, T1 = 193.23 mg/mL)，女性(T0 = 148.52 mg/mL, T1 = 178.50 mg/mL)。这些IgT值在T4期男性逐渐下降到84.14 mg/mL，在T4期女性逐渐下降到99.28 mg/mL。
图2:总免疫球蛋白claria gariepinus在接触不同浓度的Thalis 112 ECat后进行检测。数据以平均值±标准差表示。查看图2
微分白细胞数:在光学显微镜下(x100物镜)在血液涂片上观察到的不同白细胞如下图3所示。
图3:鱼体内观察到的不同血细胞。
Eo:嗜酸性粒细胞;米歇尔。内格罗蓬特:单核细胞;Tr:血小板;Bs:嗜碱细胞;Nt:中性粒细胞;呃:红细胞;Lp:淋巴细胞。查看图3
通过对涂片不同切片的阅读，可以建立鱼的白细胞公式。这些是暴露过程中鱼血液中不同比例的白细胞的平均值±标准差(表2)。暴露过程中记录的淋巴细胞和凝血细胞的水平显示，不同性别的处理之间没有显著差异(p > 0.05)。女性T0最高(96.88%)，男性T5最高(95.84%)。嗜碱性粒细胞水平也无显著差异(p > 0.05)。对照组为0.20%，T4组为0.62%，T5组为0.91%。对于中性粒细胞水平，与对照组相比，某些暴露组呈升高趋势，而其他对照组呈下降趋势。雌性的最小值和最大值分别为1.25% (T3)和2.58% (T1)， 0.83% (T0)。男性分别为0.84% (T5)和2.06% (T2)，对照组为1.95%。嗜酸性粒细胞在各个方向都有变异。女性最低为0.81% (T3)比1.25% (T0)，男性最低为0.79% (T5)比1.18% (T0)。 Concerning the Monoxytes, the trend is an increased in the level of Monocytes in contaminated groups compared to controls in both males and females.
表2:差异白细胞计数的改变claria gariepinus暴露于亚致死浓度的Thalis 112 EC中。查看表2
白细胞总数:总的来说，WBC有增加的趋势，男性的T2和两性的T5有显著差异(p = 0.04)。因此，T5的最大值为:雌性为236.43*10^3 /μL，雄性为237.2*10^3 /μL(图4)。
图4:白细胞总数claria gariepinus在接触不同浓度的Thalis 112 ECat后进行检测。数据以平均值±标准差表示。对于不同性别，带星号(*)的值与对照T0在p小于0.05时差异显著。查看图4
红细胞总数:红细胞数据的统计分析表明，从一种治疗方案切换到另一种治疗方案时，无显著差异(p > 0.05)。然而，无论性别，T5均有升高的趋势(女性为2.78±0.8*10^6 /μL，男性为2.93±0.5*10^6 /μL)。
图5:红细胞计数claria gariepinus在接触不同浓度的Thalis 112 ECat后进行检测。数据以平均值±标准差表示。查看图5
血红蛋白(Hb)内容:Hb的方差分析没有显示任何性别的统计学差异(p = 0.66)。然而，除T4期外，在所有治疗中，男性的血红蛋白水平均逐渐升高。而在女性中，这个值在T4略有增加，但基本保持不变(图6)。
图6:血红蛋白水平claria gariepinus在接触不同浓度的Thalis 112 ECat后进行检测。数据以平均值±标准差表示。查看图6
红细胞常量:基于结果(表3)，红细胞常数(MCV, MCH和MCHC)值的统计分析显示，处理之间无显著差异(p > 0.05)。但各红细胞常数值均有升高的趋势。
表3:红细胞恒值的变化claria gariepinus暴露于亚致死浓度的Thalis 112 EC中。表3视图
实验过程中(更换试验溶液前后)所测得的理化参数(温度和pH值)的变化在统计学上不显著。这意味着这些参数对于测试中的所有处理都是相同的。无论在什么时期，温度都从26.97°C到27.20°C不等。这些值是在最佳生长所需的温度范围内(26至30°C)c . gariepinus［22，23］．pH值在6.71到6.92之间变化。这些数值符合农业推荐的6.5 - 9的范围c . gariepinus［22，23］．这些温度和pH值也是Agbohessi等人得到的。[24当同一物种暴露于硫丹和Tihan 175 OTEQ 13个月时，agbohesi等人。[4，5]暴露在幼体c . gariepinus到棉花杀虫剂Thalis 112 EC和Pyro FTE 472 EC。
鱼类的血液学指标已成为评估除害剂对鱼类影响的不可或缺工具[25］．暴露于Thalis可使红细胞总数(RBC)增加，血红蛋白(Hb)含量和血球压积(PCV)稳定性有增加的趋势c . gariepinus平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)均呈升高趋势。由于MCH和MCHC来自血红蛋白和红细胞，血红蛋白和红细胞滴度的增加会导致MCH和MCHC的增加。血红蛋白和红细胞的增加暗示了鱼类在代谢分解期间提高血液中氧气运输能力的一种策略[26，27］．根据辛格和斯利瓦斯塔瓦[28]，红细胞升高可能是由于血细胞储备和由于杀虫剂的作用使血液发生渗透改变而导致的细胞收缩。MCV、MCH和MCHC等红细胞常数似乎是鱼体内平衡系统中较为敏感且可引起可逆变化的变化。据报道，由于接触二甲醚康唑和噻虫嗪，罗希托乳杆菌中MCH和MCHC显著增加[29和在Barbonymus gonionotus中由于quinalphos [30.］．据报告，由于溴氰菊酯的使用，斑点花蝗MCV显著增加[31和在B. gonionotus中由于quinalphos [30.］．
在本研究中观察到总白细胞计数(WBC)升高。白细胞增多的病理生理条件为白细胞增多[25］．有关WBC的报告显示，在溴氰菊酯的影响下，斑点锦鸡儿的WBC值显著增加[31，在C. carpio暴露于fenthion [32，在C. carpio中由于monocrotophos [33]，在暴露于硫丹和乐果的针叶藻中[34]，是由毒死蜱引起的[35]，以及暴露于敌敌畏及其技术级的蛙鳃鱼[36］．白细胞形成后，要么迁移到关键器官，如脾脏、淋巴结、肠道，要么进入血液。白细胞数量的增加可能是毒性损伤的异常结果。WBC的突然增加可能是由于动物的防御机制和免疫系统的激活。包括杀虫剂在内的几种化合物由于干扰免疫系统而产生抗体，这可能是WBC增加的原因[32］．在本研究中，WBC的显著增加可能是由于刺激了鱼的防御机制，以对抗Thalis的作用[37］．白细胞数量的增加是对农药胁迫的一种防御反应。这些变化很可能是在杀虫剂存在时激活免疫系统的结果，而这可能是鱼类的适应性反应，从而产生更有效的免疫防御[38］．这也解释了本研究中Monoxytes水平升高的原因。这一反应也被观察到在同一c . gariepinus接触毒死蜱及DDforce [39]，以及在C. carpio暴露于phenition和敌敌畏后[40，41］．这亦与较早前的研究结果一致，即发现接触二嗪农等除害剂后的结果类似[42，43),马拉松44],百草枯[45curzate [46］．在本研究中，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的水平随着嗜碱性粒细胞水平的增加而波动，而整个淋巴细胞+血小板细胞没有变化。这是在c . gariepinus肯定与Thalis的二元性有关，它由两种分子组成(苯甲酸埃马菌素和对乙酰氨基脒)，它们的作用模式不同，可能会相互中和。这种效果也可能是由于该配方中所含的佐剂，即Thalis。
免疫球蛋白是硬骨鱼适应性特异性免疫的最重要成分[47］．这个参数显示了与我们的结果相比的显著差异。T1组的鱼数量增加;这可以解释为适应性免疫反应使鱼T1组的免疫系统具有识别和记忆特定病原体的能力，然后通过记忆淋巴细胞建立更强、更快的反应[47，48］．在第一次接触有毒物质后，T1处理的鱼类会产生更强的防御能力。在其他治疗方法中观察到的显著下降可能与它们体内这种毒素的高水平有关。Mohammadalikhani等人。[49]也显示了感染Captan的C. idella的IgT下降。一些鱼的免疫活性也因高剂量重金属中毒而下降[50］．
本研究清楚地证明了Thalis 112 EC对血液生物标志物的不良影响c . gariepinus．事实上，即使污染物对红细胞压积水平、血红蛋白含量和红细胞常数(MCV、MCH和MCHC)没有显著影响，它也会诱导小鼠总白细胞计数的增加c . gariepinus．至于总免疫球蛋白，低浓度农药的存在导致先增加后降低的浓度。研究结果表明，这些参数可作为农药对鱼类及其他水生生物毒性的潜在生物标志物，应用于环境生物监测领域。
不适用。
不适用。
所有的鱼类实验都得到了学校质量控制部门的批准。
不适用。
作者宣称不存在利益冲突。
本研究产生的数据可根据通讯作者的要求获得。
所有作者都同意发表。