微管，神经系统疾病，脯氨酰寡，蛋白质相互作用，联会
脯氨酸寡肽酶(POP, EC3.4.21.26)，又称脯氨酸内肽酶，是一种胞质丝氨酸蛋白酶(81 kDa)，水解小肽(小于30残基长)的脯氨酸后键。它于20世纪70年代早期在人类子宫中被发现[1]首先被描述为一种催产素水解酶，并进一步被描述为一种肽酶，分解参与学习和记忆过程的小底物，如P物质、神经降压素、精氨酸加压素和促甲状腺激素释放激素等[2]一些研究表明，服用POP抑制剂会增加海马和额叶皮质中P物质和精氨酸加压素的水平[3.］．然而，已经有人提出POP的水解活性并不驱动其生理作用，这一观点尚不明确。在这方面，鉴于POP与其他蛋白质相互作用并调节肌醇三磷酸途径，人们提出了几种替代假说来解释POP的功能[4］．尽管需要进一步的研究来阐明这种酶的确切作用在活的有机体内在本综述中，我们重点介绍了已知的POP相互作用体及其在POP功能中的相关性。在结构上，POP是一个整体呈圆柱形的单体蛋白，由两个结构域组成。催化结构域是典型的α/β水解酶，而结构域是一个七叶β螺旋桨，其作用如同一个空圆柱体，限制了底物的大小和取向[5，6[图1]。虽然目前对POP的酶促机制还不完全了解，但通过电子显微镜、核磁共振和x射线晶体学研究，已经揭示了该酶在溶液中开放构象和封闭构象之间的平衡状态。这种平衡可以被直接活性位点POP抑制剂调节[5，7］．
POP是在人体内广泛表达，但在中枢神经系统中的浓度增加（CNS）[8，9］．在这方面，该酶在皮质和海马谷氨酸神经元、丘脑和皮质的ɣ-氨基丁酸(GABA)能和胆碱能中间神经元以及浦肯野细胞中表达[10，11］．此外，在炎性损伤后，小胶质细胞和星形胶质细胞中的POP表达升高[12］．
鉴于POP在中枢神经系统中的表达，它与神经退行性和神经精神疾病的关系已经得到解决。一些研究报告称，POP活性在阿尔茨海默病(AD)、路易体痴呆、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)和精神分裂症等患者中发生改变[9］．POP活性也被发现在情绪障碍患者的血清中发生改变，如抑郁症和双相情感障碍[13]然而，在解释这些研究时必须小心，因为其中许多研究测量了血浆或死后大脑样本中的POP。此外，实验数据表明，在东莨菪碱治疗的大鼠中，POP抑制具有神经保护、抗遗忘和认知增强特性，而它降低了细胞外乙酰胆碱浓度在这些动物的大脑皮层和海马中发现了一种新的神经递质[14，15］．POP抑制剂的认知增强特性已在其他认知障碍动物模型中得到进一步证实[16-18]和健康的人类志愿者[19-22］．此外，在皮质和小脑颗粒细胞中，POP抑制剂具有神经保护作用[23，24］．其中三种抑制剂S-17092、JTP-4819和Z-321达到了治疗AD的临床阶段[19-22］．然而，不幸的是，这些药物的发展没有超过这些阶段。
在细胞质中POP的存在，其构象动力学和能力，共同与其他蛋白质相互作用，导致了假设，即其生物功能相关的蛋白质 - 蛋白质相互作用。这个概念最早是由舒尔茨等人提出。在2005年，谁提出，POP独立调节其肽酶活性的一些细胞功能[25］．此外，已经观察到，POP抑制剂诱导酶的三级结构的变化和可以修改它的相互作用组。在文献中描述的主POP相互作用物是细胞质蛋白α突触核蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），生长相关蛋白43（GAP43）和α微管蛋白。
神经元和胶质细胞胞浆中α-突触核蛋白的异常纤维聚集是突触核蛋白病的主要特征，包括帕金森病、路易体痴呆和多系统萎缩等[26］．Brandt等人在2008年首次报道了POP对增强α-synuclein聚集的贡献[27］．此后，有研究表明POP在PD患者的黑质中与α-synuclein共定位[28]后来这两种蛋白质直接相互作用。通过微尺度热泳和表面等离子体共振研究揭示了这种相互作用[29］．此外，POP抑制逆转α-synuclein聚集并促进自噬(用于清除不溶的α-synuclein低聚物和原纤维的分解代谢途径)[30.］．这些结果表明使用POP抑制剂可以提供为突触核蛋白病的治疗中的新的方法的α突触核蛋白-POP相互作用的调控。
GAPDH是一种糖酵解酶，参与能量产生途径。然而，这种蛋白质也参与其他非糖酵解过程，包括程序性细胞死亡[30.］．由此可见，GAPDH在细胞核内的易位和积累是细胞凋亡的起始信号[31，32］．Puttonnen等人以及数年后Matsuda等人报道，POP抑制剂可防止GAPDH在氧化应激下转位进入细胞核[33，34］．随后Matsuda等通过共定位、共免疫沉淀和邻近连接实验证实了POP与GAPDH的相互作用[33］．这一信息有力地支持POP介导GAPDH核易位的观点，因此，POP可能参与了细胞凋亡的调控。
在其他cns相关功能中，GAP43参与生长锥形成和轴突引导[35，36，尽管其潜在的分子机制尚不清楚。丙戊酸、卡马西平和锂治疗可导致感觉神经元培养中生长锥的平均扩散面积增加，而这种增加可通过使用POP抑制剂逆转[37］．这一发现表明POP也与生长锥发育有关。对此，Di Daniel等提出POP的这种功能可能是通过与GAP43的相互作用来解释的。他们使用共免疫沉淀和酵母双杂交试验证明了POP和GAP43之间的结合[38］．多年后，Szeltner等人对这项研究提出了质疑，他们报道了POP和GAP43的部分共同定位，没有强烈的物理结合。在这方面，这些作者报道了两种蛋白质之间微弱和短暂的相互作用，戊二醛交联试验证实了这一点[39］．尽管存在这一矛盾，POP通过与GAP43直接或间接的相互作用参与生长锥的发育似乎是合理的。
α-和β-微管蛋白异质二聚体的重复组装构成了微管(MTs)的结构，微管与微丝和中间丝一起形成细胞骨架。因此，MTs参与了大量的细胞过程，包括有丝分裂、细胞运动、细胞形态维持、神经突生长、细胞内运输和囊泡分泌[40］．通过共定位和酵母双杂交分析，Schulz等人证实了POP结合在α-微管蛋白的c端区域[25］．他们还表明，POP抑制促进U-343细胞中蛋白质和肽的释放。这些结果表明，POP参与了mt相关的过程，如细胞内运输、蛋白质分泌和轴突运输。
由于几种POP抑制剂已被证明可以改善动物的记忆和认知，人们已经使用其他方法研究了POP在突触功能中的可能含义。
首先，在所提出与GAP43，作者还产生POP敲除（KO）小鼠POP相互作用相同的出版物。当与野生型（WT）小鼠相比，这些动物用于证实不存在POP的引起的折叠生长锥的数量，并增加了在植其扩散面积的减小[38］．同样，他们观察到，用丙戊酸、卡马西平或锂(它们都被认为是情绪稳定剂)处理的WT小鼠外植体也显示出生长锥数量的减少。然而，POP抑制剂的治疗逆转了这三种情绪稳定剂的效果。Höfling等也确定POP KO小鼠的聚唾液酸神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)表达增加[41]，其已经用增强脑可塑性相关联42］．另外，D’agostino等人使用POP基因陷阱小鼠来研究POP在突触中的参与。他们观察到，这些小鼠表现出海马的长期增强减弱，与海马相关的学习和记忆过程受损，海马的脊柱密度下降，特别是在CA1区域，以及GAP43表达减少[43］．
鉴于这些观察结果，POP似乎参与了神经元突触的调节。虽然这种调控的分子机制尚不清楚，但POP- gap43和POP-α-微管蛋白的相互作用可能提供了一个解释。在这里，我们概述了关于α-微管蛋白和MT参与突触过程和与POP失调相关的神经系统疾病的一些基本观点。
如前所述，MTs是细胞骨架的主要组成部分，因此它们存在于所有真核细胞类型中。MTs的主要特性是其动态特性和方向性。构成MT结构的α-和β-微管蛋白异质二聚体的取向对这些细胞骨架组分的极性和稳定性尤为重要。MT的(-)端有一个暴露的α-微管蛋白亚基，而(+)端(发生MT伸长)有一个暴露的β-微管蛋白。神经元MTs的特征是形成神经突生长和维持所需的束[40，44，已经描述了轴突MTs是均匀定向的，(+)端指向轴突尖端，而在树突中，MTs呈现混合方向(图2)。轴突和树突MTs的另一个区别是它们的主要微管相关蛋白(MAPs)。Tau蛋白主要存在于轴突，MAP2主要存在于树突。尽管存在这些差异，但人们普遍认为，MT动力学在确保轴突和树突的正确功能，进而在记忆、学习和其他认知过程中发挥着关键作用。确实，MTs与其他蛋白质合作，参与调节轴突和树突细胞内货物运输，以及调节树突棘形态和突触可塑性[45，46］．
神经退行性疾病通常以MT质量减少、极性模式中断和轴突运输受损为特征，部分原因是MT稳定性降低[40，47］．这些发现支持了这一观点，即调节MT动力学可能提供一种潜在的治疗方法，通过它改善与神经系统疾病相关的认知障碍。鉴于已报道的α-微管蛋白和POP之间的相互作用以及这些蛋白在突触过程中的作用，不能排除POP以及POP抑制调节MT动态(图3)。POP与α-微管蛋白的相互作用及其可能在MT稳定性中的作用有待进一步研究。
POP被认为是治疗某些中枢神经系统疾病(包括精神分裂症、PD和AD等)认知障碍的一个有前途的靶点。这一建议是基于三个主要的观察结果而提出的:i)患有这些疾病的人的大脑中POP的含量发生了变化[13];ii) POP对脊柱密度和形成的假设影响[38，41-43);iii)关于与POP相互作用的分子的有希望的发现[25，29，33，38］．
根据世界卫生组织的数据，精神分裂症是一种神经精神疾病，影响着全世界1%以上的人口。患有这种疾病的个人可以表现出三种类型的症状：阳性、阴性和认知。市场上有几种治疗阳性和阴性症状的抗精神病药物。然而，迄今为止，没有该药物已被批准用于治疗认知障碍。POP成为治疗精神分裂症认知症状的一个有希望的靶点[48］．Prades等人发表了关于这个适应症的成功结果。在该研究中，三种不同的精神分裂症小鼠模型——以亚慢性苯环啶(PCP)或急性地唑平(MK801)为基础，以及在怀孕期间由多肌苷:多胞苷(PIC)引起的母体免疫激活为基础——用POP抑制剂IPR19治疗。这些作者在一些评估工作和视觉记忆的认知测试中表明，这种抑制剂逆转了受损的认知症状[49］．由此可见，POP抑制在精神分裂症动物模型中具有增强认知的作用。
精神分裂症患者的树突棘发生了改变。这些异常在多个大脑区域都有观察到，特别是在新皮质的第3层，那里的锥体细胞呈现出较低的最小棘密度。据推测，这些棘缺损可能出现在儿童早期和青少年期由于脊柱形成、修剪和/或维持等分子机制的干扰而导致的y[50，51］．POP抑制剂可能能够恢复树突脊柱缺损，因此有助于改善认知症状。
帕金森病是一种神经退行性疾病，其特征是黑质神经元缺失和路易小体的聚集，路易小体包括聚集形式的α-突触核蛋白。如前所述，α-synuclein在黑质中与POP共同定位并相互作用[28，29］．然而，在PD和对照组之间并没有观察到POP活性或表达的差异[28］．
微管蛋白与α-突触核蛋白相互作用的观察表明，MTs参与PD[52]此外，α-突触核蛋白与MT稳定有关，尽管其作用机制尚不清楚。有人提出，α-synuclein是一种MAP，因此它调节MTs的稳定、聚合和动力学。另一个假设是，α-synuclein和GSK-3β之间的相互作用调节Tau磷酸化，从而调节MT的稳定。然而，这两个假设并不一定是排他性的[53］．
Myöhänen等证实POP参与α-synuclein聚集。在这方面，这些作者表明，POP抑制剂KYP-2047通过增强A30P转基因小鼠PD模型的巨噬细胞，刺激α-synuclein聚集物的清除[30.］．
AD的标志是错误折叠的β-淀粉样肽斑块在细胞外空间的积聚，以及磷酸化的Tau蛋白在神经元中的聚集，这一过程导致神经原纤维缠结。AD患者的大脑显示POP的表达和活性发生改变，并且这种蛋白酶也被观察到与局部细胞发生协同作用在该器官细胞内和细胞外与β-淀粉样蛋白结合[9，29］．Tau蛋白在AD和对照大脑细胞内与POP共定位[26］．
MTs与AD的发展有关，其长度和密度的减少证明了这一点[54]，其指示突触过程的一个可能的改变。在这方面，在AD的早期阶段，β淀粉样蛋白会改变改变树突棘形状，而在后期阶段到β淀粉样蛋白的毒性的引线蜂窝响应于MT密度和长度以及树突棘的损失[减少55］．
HD是一种以运动、精神和认知缺陷为特征的遗传性神经退行性疾病[56]。认知障碍是该疾病的最早症状之一。HD是由人类亨廷顿基因（HTT）外显子1内异常CAG重复扩增引起的[57]，编码亨廷顿蛋白。突变的亨廷顿蛋白形成寡聚体和球状中间产物，导致聚集，进而促进神经元功能障碍和神经退行性变[58]。
HD是另一个病理过程的例子，与对照组相比，患者大脑样本中的POP活性降低[60]因此，HD表现出MTs和细胞骨架的异常，其中大多数异常与MAP失调有关。死后HD大脑样本表现出过度磷酸化的Tau聚集体，这是在AD中观察到的一种现象[60].由MAP2失调引起的树突萎缩，可能由剪接改变事件引起，也有报道[61]。
AD、PD、HD、精神分裂症等神经性疾病患者POP表达模式改变。此外，在过去的二十年中，设计和测试了这种丝氨酸蛋白酶抑制剂，用于治疗与这些疾病相关的认知障碍。POP抑制剂已被广泛证实在体外和在活的有机体内增强认知和神经保护特性。然而，尽管其中一些候选药物已达到临床阶段，但POP效应背后的生物学机制仍不清楚。尽管如此，蛋白酶的催化活性传统上被认为是负责POP生物活性的功能，一个新的有前景的假设属性在活的有机体内该蛋白酶的功能，其参与关键的生理相关的蛋白质-蛋白质相互作用。
最有前途的POP相互作用体之一是α-微管蛋白，它是形成MT结构的异源二聚体的组成部分。在这方面，一些神经系统疾病的特征是MTs的稳定性和形成的改变，以及脊柱密度的缺陷。
根据本文回顾的研究结果，POP成为治疗与某些神经疾病和精神疾病相关的认知障碍的潜在新靶点。现在，研究工作应该转向研究POP与α-微管蛋白的结合，POP在细胞骨架和神经突起生长中的潜在作用，以及POP抑制剂作为MT稳定剂的作用。
n.t.， A.A-Ll, R.P.和T.T.是Iproteos, S.L.的雇员。T.T.是Iproteos, S.L.的创始人
N.T.和A.A-Ll.起草了手稿，R.P.和T.T.对手稿进行了修改。所有投稿人都进行了修改，批准了手稿的最终版本，并同意对工作的各个方面负责。