促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)与焦虑和压力有关:它刺激促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放。此外，儿茶酚胺增加ACTH的释放，而血清素(5-HT)增加ACTH和CRF。< / p >
伏安法电化学技术与特殊处理的碳纤维微电极(CFE)结合使用，可以在体内同时检测离散大脑区域的儿茶酚胺、血清素和多肽。因此，这种方法可以与压力-焦虑-抑郁的行为模型相结合。< / p >
为分析建立应激-焦虑-抑郁活体行为-神经化学实验模型的可行性，提出了初步数据和实验建议。特别是，验证5-HT和ACTH系统之间的直接关系，该系统位于高度参与多种生理和行为活动的离散脑区，如情绪、警觉性、记忆和对压力的适应性反应，目的是可能制定这种病理状态的新药物治疗策略。< / p >
促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)，应激-焦虑-抑郁，体内伏安法，儿茶酚胺，血清素(5-HT)， FST试验< / p >
促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)和精氨酸抗利尿激素(AVP)都是在下丘脑合成的，在应激、焦虑的情况下，它们会刺激前垂体释放肾上腺皮质激素(ACTH)[1-4]。< / p >
此外，在啮齿类动物中，中央儿茶酚胺刺激ACTH的释放，通过CRH的分泌介导(综述见[5]，而血清素(5- ht)增加ACTH和CRF的释放，并促进AVP在应激情况下释放ACTH的能力[6-9]。< / p >
伏安法，特别是差分脉冲伏安法(DPV)是一种电化学技术，它与特殊处理的碳纤维微电极(CFE)结合使用，可以同时检测麻醉大鼠和意识自由活动大鼠大脑离散区域的儿茶酚胺、血清素和多肽[10,11]。< / p >
因此，这种方法可以与应激-焦虑-抑郁的行为模型相结合，如混合了情绪和身体压力的强制固定[12]，有关回顾见[13]，或强制游泳测试[14,15]或恐惧条件反射[16,17]。< / p >
这种方法的结合将允许实时监测单胺类神经递质的选择性变化，并在动物屈服于这种厌恶条件的特定大脑区域进行选择。特别是边缘系统的组成部分，如杏仁核、下丘脑和与杏仁核相互连接的区域，如海马体，参与了对厌恶刺激的情绪反应[18-20]。因此可以对这些区域进行研究。特别是杏仁核可能是首选靶点，据报道该区域25%的神经元含有CRF[21,22]。< / p >
此外，据报道蓝斑位点(LC)还参与了一些生理和行为活动，如情绪、警觉、记忆和对压力的适应性反应[23]。应激刺激可触发LC神经元，改变其电生理活性，诱导儿茶酚胺[24]的释放。LC在大脑中含有最多的儿茶酚胺能细胞，支配神经轴的大部分区域[25,26]。它的刺激决定了ACTH的释放和焦虑样行为以及其他与压力相关的反应(评论见[27])。CRF和中枢性儿茶酚胺之间的相互作用已经有报道，在中枢神经系统中给药CRF会改变LC神经元的活性和末端区域的儿茶酚胺能代谢，并刺激下丘脑和前额叶皮层的儿茶酚胺释放(综述见[27])。LC神经元的这种功能改变与情感和应激相关障碍的病理生理学有关[4,28]。< / p >
广泛的啮齿动物和人类研究表明，海马体对压力高度敏感，长时间暴露在压力下会导致神经元的损失，特别是海马体[29]。海马体在终止HPA轴对压力[30]的反应中也起着重要作用。海马病变增加了促细胞CRF和AVP的表达，延长了应激[31]时ACTH和皮质酮的释放，而海马流向下丘脑的流出源起于脑室亚和海马CA1区(CA1)，即LC[30]的终末区。此外，有数据表明，压力会提高海马体[32]中的5-HT水平，从而表明5-HT参与了应激对海马体的影响。< / p >
在前人研究表明蓝斑和海马体是对压力情景最感兴趣的大脑区域的基础上，对这两个结构进行了初步的研究。电化学伏安法技术与特殊处理的碳纤维微电极(CFE)已被应用于体内同时检测儿茶酚胺能和血清素能水平。在LC中进行了伴随的电池放电测量。这种电化学和电生理技术的联系可以与应激-焦虑-抑郁的行为模型相结合[33]。< / p >
为分析建立应激-焦虑-抑郁活体行为-神经化学实验模型的可行性，提出了初步数据和实验建议。特别是，为了验证5-HT和ACTH系统之间的直接关系:目的是制定对这种病理状态的药理学治疗的新策略。< / p >
用直径为30 μ m的碳纤维制备的cef30µm进行了体内微分脉冲伏安(DPV)和电生理实验。他们首先被电处理，即70赫兹的三角波形应用在三个阶段:0到+2.2 V 8秒，0到+1.8 V 10秒，0到+1.2 V 10秒。然后应用两个连续的电位:-1.0和+0.5 V，各持续4秒。将辅助电极、参比电极和工作电极浸泡在pH值为7.4的0.1 M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行电化学处理。然后在电极尖端涂上Nafion，这样就可以选择性地同时测量儿茶酚(去甲肾上腺素、多巴胺)和血清素(5-HT)[34,35]。< / p >
雄性成年大鼠(Wistars, 250-280 g)由Charles-River(意大利)提供，饲养在温度和湿度控制的房间(22℃，50%)。所有动物程序都是根据意大利法律(第1号法令)进行的。第116号，1992)，承认欧洲指令86/609/EEC，并完全符合葛兰素史克关于实验动物的护理和使用政策和操作规范。此外，他们尽一切努力尽量减少动物的数量和它们的痛苦。< / p >
动物被麻醉(水合氯醛，500 mg/kg i.p)，放置在立体定向框架中，并准备进行先前描述的微分脉冲伏安(DPV)和电生理分析[33,35]。< / p >
特别地，一个DPV微生物传感器被立体定向地插入蓝斑(LC)即细胞体区域，然后，在同一动物中，第二个CFE被植入海马(CA1)即LC末端区域，根据Paxinos和Watson[36]的坐标(见图1)。< / p >
这两个微传感器之前都用Nafion进行了化学处理，因此可以对儿茶酚(去甲肾上腺素、多巴胺)和血清素(5-HT)进行选择性的同时DPV测量[11,33,35]。< / p >
如前所述，神经递质的体内差分脉冲伏安(DPV)测量以及细胞放电的电生理学检测已陆续进行[11,33,35]。< / p >
在这些动物中，脑室内灌注CRF(1µg)或aCSF(4µl人工脑脊液:对照大鼠)决定了图2、图3和图4所示的结果。特别是，这些数据显示CRF显著增加了LC中的细胞放电(图2)和CA1中的儿茶酚水平(图3)。相反，在5-HT水平上没有观察到显著变化(图4)。< / p >
目前关于这种治疗后儿茶酚活性改变的数据与报道一致，报告显示脑室内灌注儿茶酚胺通过α 1和/或β受体对诱导大鼠应激样ACTH突增有直接作用[27,37]。LC中获得的初步DPV数据再次表明儿茶酚水平发生了变化，但5-羟色胺水平没有显著变化(图5和图6)。相比之下，其他研究表明LC和血清素在调节暴露于压力源[38]的影响方面发挥了作用。差异可能与所采用的不同方法有关，即推拉导管，收集的过融合物可能有血液污染，然而，下文提出的进一步研究将有助于阐明这种差异。< / p >
行数据进行方差分析，“对照”(车辆)和“处理”值之间的比较使用Bonferroni (Dunn’s)检验。结果以对照值的%表示，平均值±s.e.m.， *p < 0.05， **p < 0.001。< / p >
可以准备不同组的大鼠(每组n = 5)同时进行伏安测量和电生理记录，然后暴露于强制游泳试验(FST)，如前所述[33]，以监测这种应激条件对单胺能活性的影响。< / p >
FST是一种预测多种抗抑郁药物临床疗效的行为测试。< / p >
通过同样的用于伏安测量的微生物传感器(CFE)，电生理记录也可以进行[33]。因此，可以在naïve对照组(n = 5)和“FST行为处理”大鼠(n = 5)的杏仁核中监测胺类神经递质活性和放电水平的平行双探针分析。在中缝背核(RDN)中也可以进行类似的研究，该区域是血清素细胞最丰富的大脑区域，与杏仁核之间存在明显的相互联系[39,40]。在5只对照大鼠和5只“FST大鼠”中进行的进一步研究将允许在细胞体(RDN)水平和突触间隙(杏仁核)水平上具体分析血清素能系统。在单相抑郁症患者中，该系统的活性降低确实是众所周知的[41,42]。< / p >
i)载药(aCSF 4µl，对照大鼠，n = 5)， ii) CRF(1µg, n = 5)，或iii) AVP(1µg, n = 5)，或iiii) ACTH(1µg, n = 5)，(或异丙肾上腺素:释放ACTH[43]的化合物)。< / p >
从这两组实验测试中收集的数据可用于分析:< / p >
a)预测多种抗抑郁药物临床疗效的行为测试对离散脑区单胺能系统的影响，这些脑区与情绪、警觉性、记忆和对压力的适应性反应等几种生理和行为活动高度相关。< / p >
b)与应激刺激反应相关的化合物选择性化学处理对应激-焦虑-抑郁大鼠单胺能活性的影响。< / p >
这些研究将允许验证应激-焦虑-抑郁的活体行为-神经化学实验模型的建立，即naïve与应激-焦虑-抑郁的大鼠相比，行为或药物治疗后的电化学和电生理结果的伴随性将阐明CRF(和ACTH)作为应激-焦虑-抑郁状态的推定内源性责任的作用。< / p >
该实验行为-神经化学体内模型将允许验证CRF拮抗剂对行为反应和电化学-电生理参数的有效性，数据将强调这些化合物在应激-焦虑-抑郁状态下的疗效。简单地说，采用应激-焦虑-抑郁行为模型的大鼠或/和接受CRF(异丙肾上腺素，ACTH)治疗的大鼠将在之前接受CRF拮抗剂治疗。然后实时监测伴随的行为和神经化学活动。< / p >
此外，以下(以及其他)来自文献的其他证据支持5-HT和ACTH系统之间的直接关系:< / p >
•5-HT1A受体激动剂5-OH-DPAT和5-HT2受体激动剂DOB增加血浆ACTH(和皮质酮)。DOB可能通过CRF起作用，作为CRF拮抗剂(α -螺旋CRF9-41)的预处理，显著减弱了ACTH对DOB的反应[44-46]。< / p >
•5-羟色胺消耗剂(即5,7- dht, PCPA)在降低5-羟色胺水平的同时，也会导致ACTH水平的降低[47-49]。< / p >
人类精神障碍的动物模型的有效性通常由一系列条件进行评估，慢性压力是在大鼠中显示主要有效性的条件之一(综述见[50])。特别是FST似乎是一种有用的方法来研究啮齿类动物(积极)药物对临床治疗重大抑郁症[51]的影响。< / p >
因此，针对这两种系统(即CRF受体拮抗剂和5-HT受体拮抗剂的联合作用)，提出的实验行为-神经化学体内模型，可能有助于理解它们在应激-焦虑-抑郁状态的行为模型中的共同含义，从而可能制定这种病理状态的新药物治疗策略。< / p >