盐酸氯丙嗪(CPZ)指的是抗精神病药物。CPZ是治疗精神分裂症的首选药物。然而,它的影响主要的兴奋性神经递质系统,glutamatergic,尚不清楚。这个问题是我们研究的目的。实验老鼠的嗅觉皮层脑片。我们使用电生理技术脑片细胞外记录调查CPZ影响的活动glutamatergic ionotropic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic受体(AMPAR)和N-methyl-D-aspartic酸型谷氨酸受体(NMDAR)。应用程序在不同浓度CPZ AMPAR和NMDAR修改活动。这些反应阶段:初始激活和随之而来的大萧条AMPAR CPZ浓度的10 - 6 M和身手M . NMDAR在浓度较低的情况下,尤其CPZ(10 - 6米和纯米)初始激活,最后的接触,这些受体是沮丧。在测试的可逆性洗激活AMPAR仍然升高,明显不同于控制的价值观。在清洗活动NMDAR回到控制值。 In order to improve functions of NMDAR slices pretreated by ammonium chloride (NH4Cl, 20 mM) which is commonly recognized as fast and efficient lysosomal inhibitor. Such processing of slices and subsequent action of CPZ protected the functioning of NMDAR. Thus, data presented in this study on the influence of CPZ on the ionotropic glutamatergic mechanisms allow understanding the multifaceted mechanisms action of CPZ in protection the deterioration of mental disorders such as schizophrenia.< / p >
氯丙嗪、精神分裂症、大脑切片,领域的潜力,氯化铵< / p >
氯丙嗪(CPZ)是世界卫生组织名单上基本药物仍然是治疗精神分裂症的首选药物,尽管其他药物的出现[1,2]。< / p >
盐酸氯丙嗪(一些同义词aminazine largactil、氯丙嗪等),最常用的CPZ诊所,指的是一群抗精神病药物。二甲胺吩噻嗪的导数,化学式为C17H20Cl2N2S和分子量:355.321克/摩尔。在温血动物的血,它与血浆蛋白相互作用,它的蛋白结合达到90 - 99%。的时候,它的半衰期是30±7个小时,这表明其长期稳定性[3]。< / p >
主要药理作用是antipsychotropic。它还产生镇静和止吐剂活动。CPZ行动在所有级别的中枢神经系统,主要在大脑的皮层下结构——中脑网状结构。CPZ antiadrenergic强和弱边缘抗胆碱能活性。它还具有轻微的抗组胺剂和antiserotoninergic活动(4、5)。< / p >
目前交互CPZ多巴胺受体的主流观点。同时对主要的兴奋性神经递质系统的影响,glutamatergic,几乎没有被研究过,尽管一些零碎的数据证实这样的相互作用[6]。这个问题的重要性在于,近年来开发了集中精神分裂症的发病机理理论,在这种疾病的主要角色扮演一个扰动glutamatergic中介系统。确认“glutamatergic”假说是基于事实,引入动物NMDA-dependent谷氨酸受体的拮抗剂(苯环己哌啶、氯胺酮、mk - 801等)是最常见的和足够的精神分裂症模型[7]。门冬氨酸受体拮抗剂引起人类行为障碍的,这非常类似于精神分裂症的临床表现[8]。苯环己哌啶注射可引起记忆障碍没有精神病的证据。慢性接触nmda拮抗剂导致认知障碍(如精神分裂症)[9],这被认为是与功能障碍相关的NMDAR [10]。< / p >
不足的具体影响机制的数据CPZ glutamatergic受体机制促使我们调查CPZ影响关键的活动glutamatergic ionotropic受体,在alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPAR)和N-methyl-D-aspartic酸型谷氨酸受体(NMDAR) [11], AMPAR实现快速传输突触激发大多数脊椎动物的中枢神经系统。NMDAR家族受到了特殊的关注,因为它独特的作用在调节突触可塑性-长期势差/抑郁和双向突触细化[12],因为它的关键作用在神经和精神疾病[13]。次于或hyper-activation NMDAR至关参与疼痛放大、中风、癫痫、精神分裂症、创伤后应激障碍、痴呆、抑郁症和各种神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症)[13]。< / p >
的影响在实验研究中,CPZ AMPAR和NMDAR很重要,选择一个适当的和最佳的实验对象,并没有显著的多巴胺和羟色胺神经递质系统的影响,因为这些受体CPZ块。因为我们的研究进行切片Wistar鼠的嗅觉皮层。这些片的优点是,在它们存在并积极操作AMPAR和NMDAR在激发移动的基本功能,也在更复杂的学习过程。多巴胺和血清素激活的受体在这片是一个最低[14]。这些数据让我们忽略这些神经递质系统的参与作用下CPZ和提交参与AMPAR NMDAR在“纯形式”片。< / p >
此外,为了理解的初始过程CPZ我们研究的变化活动的AMPAR和NMDAR在刺激外侧嗅束神经网络,这是主要的传入嗅觉皮层细胞的输入。< / p >
Wistar鼠体重100 - 150克从植物园(巴甫洛夫生理学研究所RAS圣彼得堡,俄罗斯)。所有实验进行符合道德标准的欧盟指令2010/63 / 2010年9月22日欧洲议会和理事会的保护动物用于科学目的。< / p >
研究进行雄性Wistar鼠体重100 - 150克(巴甫洛夫生理学研究所的植物园,RAS)。在这个工作片的使用方法制备及其孵化如我们之前所述出版物[15]。切向450 - 500片嗅觉皮层µm厚被削减的雄性老鼠的大脑与体重100 - 150克。< / p >
准备的部分转移到一个玻璃小瓶,每片preincubated 1 h 1毫升的人工脑脊液(aCSF) 37℃, pH值7.21 - -7.24。aCSF的作文如下(毫米):氯化钠- 124.0,氯化钾- 5.0,氯化钙- 2.6,KH2PO4 - 1.24, MgSO4 - 1.2, NaHCO3 - 3.0, tris-HCL (pH值7.4)- 23.0,葡萄糖- 10.0。aCSF与O2的时候。< / p >
电刺激和记录技术细胞外领域潜力(FPs)诱发使用铂定制的双极刺激电极定位到外侧嗅束(很多)。刺激是应用矩形脉冲(时间- 0.1毫秒,强度-1.5 - 1.2 V,频率- 0.003赫兹)使用刺激ESU-1(俄罗斯)。< / p >
FPs是用玻璃微电极记录满1 M氯化钠与1 - 5 MΩ尖阻力。注册一个NTO-2信号放大器(俄罗斯),数字化的模拟-数字转换器MD-32(俄罗斯)和存储在电脑上。一个银参比电极位于室的地板上。< / p >
在本研究中,我们记录和分析变化振幅AMPA和门冬氨酸EPSP。振幅的FP突触后成分我们估计等值线的峰值水平,如图1所示(第一行记录)。的振幅AMPA EPSP我们评估在一个2 msec窗口集中的峰值响应。NMDA EPSP峰值测量的平均潜在中观察到一个8 msec窗口[15]。< / p >
化合物制备aCSF和NH4Cl由Chimreactiv公司(俄罗斯)、盐酸氯丙嗪收到从莫斯科(俄罗斯)内分泌工厂。CPZ溶解在修改aCSF, NaHCO3被淘汰,因为它形成不溶性沉淀在接触CPZ代替等量的生理盐水。< / p >
我们研究的影响CPZ在10 - 6浓度,浓度的纯和身手m .尤其这些CPZ被选在浓度达到类似于精神病患者的大脑[16]。起初,灌注片控制aCSF和FPs记录在15分钟。在分析了FPs的组件突触后成分的振幅,AMPA和门冬氨酸EPSP反映AMPAR的活动和NMDAR,分别。这些值作为控制CPZ的后续行动。然后灌注切片CPZ 30分钟以上浓度之一。在此期间,在NMDA和AMPA EPSPs记录和分析。灌注结束后,切片被控制在30分钟aCSF洗,并确定这些受体的活性。FPs记录控制存在的条件和CPZ(30分钟)。很多是刺激控制条件和治疗期间与测试物质频率0.0033赫兹。< / p >
振幅的变化的统计分析单独FP组件使用nonparametrical U测试执行,Wilcoxon-Mann-Witney配对符号秩检验(P≤0.01)。数据提出了均值±S.E.< / p >
为了了解在临床条件下CPZ修改ionotropic谷氨酸受体的活性,它已经被应用在不同剂量片。这些受体的活动后的切片记录添加不同剂量的CPZ洗澡的媒介。注册在30分钟的FPs CPZ行动。< / p >
如图1所示的CPZ 10 - 6 M诱导初始浓度增加后减少的振幅NMDA和AMPA EPSP。为了评估交互的程度与AMPAR CPZ NMDAR和持续时间对这些受体机制的影响,我们一直在使用测试可逆性CPZ行动在洗。这对于可逆分析CPZ行动10 - 6 M抗浓度显示影响安定。最后洗NMDA和AMPA EPSP振幅值超过了控制(图1一个洗30分钟)。< / p >
增加灌注介质浓度CPZ纯米不引起的激活期间AMPARs洗(图1 b)。相比之下,激活NMDARs增加(图1 b, 10分钟)和行动CPZ年底下降(图1 b, 30分钟)。的测试活动的可逆性AMPARs和NMDARs都等于控制值(图1 b,洗,30分钟)。< / p >
CPZ 4浓度打败M诱导AMPARs和NMDARs的不同反应。所以,振幅AMPA EPSP增加的初期行动CPZ(图1 c, 7-20 min)和30分钟等于控制价值(图1С,30分钟)。令人惊讶的是,激活NMDAR在20分钟没有变化,但30分钟下降低于控制值。在测试的可逆性的激活AMPARs和NMDARs都高于对照值(图1С洗30分钟)。< / p >
研究结果显示“非线性”效应的CPZ AMPAR和NMDAR活动。这表明多个CPZ对NMDA和AMPA受体的功能。< / p >
为了了解影响CPZ在不同浓度的活动AMPAR和NMDAR,我们研究了存在剂量依赖的相关性模式。AMPA和门冬氨酸反应研究了根据时间的行动CPZ在测试不同浓度以及可逆性在洗。人们已经发现,当浓度最低CPZ(10 - 6米)激活AMPAR增加。此外,这些变化阶段:初始瞬时振幅增加AMPA EPSP(1 - 7分钟)。最终行动CPZ激活AMPAR减少,没有统计控制不同的价值观。在测试的可逆性洗发现激活AMPAR仍然升高,明显不同于控制值(图2)。CPZ的浓度(纯米)并没有导致AMPAR显著变化在行动和洗涤(图2)。< / p >
4应用程序在高浓度片CPZ(打败M)逐步增加激活AMPAR引起的。小幅度增加AMPA EPSP的时间范围7 - 15分钟。增加激活AMPAR从16 - 20分钟。然而,重要的进一步行动CPZ在这个浓度水平的激活AMPAR拒绝控制值结束时他的行动。在测试的可逆性激活AMPAR增加,持续洗(图2)。< / p >
门冬氨酸反应的模式变化的行动CPZ不同浓度不同于AMPA反应。当使用低浓度CPZ(10 - 6米和纯米)NMDAR增加活动。此外,低浓度CPZ(10 - 6米),这是短期激励在3 - 7分钟,然后曲线横坐标平行。在浓度CPZ (10 - 6 M,纯米)激活NMDAR结束时他的行为控制相比大幅下降。在洗涤NMDAR,活化增加,但短期内洗5分钟。继续AMPAR活动没有不同于控制值(图2 b)。< / p >
最高浓度CPZ(身手M)尤其引起了轻微抑制激活NMDAR 7 - 15分钟和最大抑制神经松弛药是年底的行动。在测试的可逆性洗激活NMDAR增加,但这些值未达到统计上的显著水平(图2 B)。< / p >
进一步澄清存在剂量依赖的相关性特征CPZ行动我们确定这些特征总结为固定时间点,15分钟CPZ行动。这是为了隔离的直接影响CPZ AMPA和门冬氨酸依赖机制。比例仅对NMDAR剂量效果观察,而对于AMPAR这样的规律没有发现(图3和图3 b)。也许,CPZ修改活动单独的子单元NMDA和AMPA受体复合物。< / p >
是否有可能,消除负面影响的CPZ ionotropic glutamatergic受体已经透露和上面描述的吗?为了验证这个假设,我们使用预处理片使用氯化铵(NH4Cl)。NH4Cl是一种非常有效的抑制剂的溶酶体功能和压迫溶酶体蛋白酶的功能。这种化合物(Na + / H +离子载体)通常被认为是快速和高效的溶酶体抑制剂(17、18)。我们已经表明,氯化铵减少了高亲油性的CPZ NMDAR功能,防止恶化。aCSF制备的含有氯化铵,20毫米氯化钠被孵化的解决方案,分别。它已经发现,NH4Cl 10 - 30毫米范围没有改变的活动NMDAR(控制、73.1±3.6%亦然NH4Cl, 70.9±3.7%,非参数Wilcoxon-Mann-Whitney U = 23日n = 7, P > 0.05)。< / p >
孵化片NH4Cl和后续行动的CPZ(纯米)转移NMDAR反应的模式(图4)。初始激活这些受体的短期(7.1±2.3分钟)。峰值振幅的变化NMDA EPSP并不不同于控制值(+ CPZ NH4Cl 20毫米,纯M: U = 25;n = 7;P≥0.05亦然CPZ,纯M: U = 8;n = 7;P≤0.05)。期减少NMDAR活动是渐进的。在洗涤这些受体机制活动保持不变(图4)。这些发现表明CPZ改变相位的方式NMDAR的功能。重要的是,溶酶体抑制剂NH4Cl消除负面影响CPZ NMDAR的活动。我们相信NMDAR活动的复苏,因为NH4Cl封锁了高亲油性CPZ和消除其负面影响这些受体。< / p >
在目前的研究中我们调查CPZ的影响,一种广泛使用的抗精神病药物,活动的ionotropic glutamatergic受体,AMPAR NMDAR。我们发现CPZ与AMPAR ionotropic谷氨酸受体和NMDAR。CPZ演示了对这些受体表达神经营养作用机制:它修改了振幅/时间的特点这些受体的活动改变了这些受体复合物动力学产生复杂的相互作用。< / p >
CPZ在活动的影响AMPAR和NMDAR在大脑切片技术研究了大鼠嗅觉神经元,胞外记录字段势在嗅觉的梨状皮层脑片。< / p >
吩噻嗪及其衍生物具有低电离电位和活性自由基形成,这与许多物质如蛋白质反应,酒精,碳酸盐,许多药物[4]。这些数据都考虑在我们研究的影响当CPZ NMDA和AMPA受体在大脑切片。因此,碳酸盐岩盐、蛋白质和肽neuroprotectors被排除在孵化的解决方案。< / p >
此外,电生理分析表明,在浓度类似精神分裂症患者脑脊液中发现,当评估dose-relationships, CPZ非线性方法修改AMPAR活动增加浓度。相反NMDAR活动以线性的方式减少增加浓度CPZ孵化的媒介。< / p >
CPZ的非线性效应可以解释为活性自由基的形成。这些物质的反应与神经元及其膜尚未建立。也许他们的亲油性的形成有助于降低,这个过程被记录由美国减少的幅度NMDA EPSP CPZ行动20分钟后(图2)。< / p >
在这些研究结果的解释应基于事实CPZ修改神经元的膜的物理化学性质。在我们看来,这是由于高亲油性CPZ。所以,CPZ增加膜流动性和渗透性的安定的神经元。这是导致细胞膜的整体不稳定。据透露,分布aliphatic-type phenothiazine-derivate安定药物在很大程度上取决于他们的交互与磷脂膜[19]。重要,CPZ带一个正电荷,使其积极与带负电荷的交互细胞膜脂质[20]。也建立了CPZ 14直径孔的形成引起红细胞的细胞膜。这些数据令人信服地证明CPZ可以修改神经元膜和相应改变钠和钾电流参与代AMPA EPSP。< / p >
长期行动CPZ修改活动AMPAR NMDAR在不同浓度阶段:初始激活和随之而来的大萧条。然而,它被发现在我们的实验中浓度的AMPAR CPZ 10 - 6 M和身手M .至于NMDAR在浓度较低的情况下,尤其CPZ(10 - 6米和纯米)初始激活,最后的接触,这些受体是沮丧。在测试的可逆性影响,CPZ洗初始活动AMPAR和NMDAR恢复。< / p >
我们建议的模式激活这些受体的影响与CPZ AMPAR和NMDAR在不同的网站。我们相信CPZ抑制效应可以解释这个抗精神病药物保护作用,发现在不同的模型。CPZ对神经系统的保护作用是支持体外和动物实验包括缺氧[21],缺血[22]和glutamate-induced神经毒性[23]。< / p >
上述数据表明CPZ行动的负面影响在长期ionotropic glutamatergic受体机制。消除这些不利影响CPZ我们考虑,CPZ高亲油性。这种抗精神病药物增加膜流动性和渗透性神经元膜。据透露,分布aliphatic-type phenothiazine-derivate安定药物,包括CPZ,很大程度上取决于他们的交互与磷脂膜[19]。这将导致膜结构及其功能的变化。< / p >
透露,CPZ渗透进入细胞并促进渗透的物质:ATP、ADP、葡萄糖6-phosphate,和果糖1,6-bisphosphate (24、25)。也许,CPZ渗透神经元减少NMDA EPSP振幅20分钟后安定操作(图2)。我们假设NMDA通道可能是端口渗透CPZ分子进入细胞。与此同时,这个复杂的问题需要进一步的研究。< / p >
解决这个问题的负面影响的CPZ AMPA和NMDA-dependent机制存在的实验进行了“溶酶体抑制剂”,氯化铵。这种化合物(Na + / H +离子载体)通常被认为是快速和高效的溶酶体抑制剂[18]。细胞的溶酶体捕获是一个重要的机制和身体的分布基本精神药品,如吩噻嗪精神安定剂[19]。我们假设氯化铵降低高的亲油性CPZ NMDAR功能和保护恶化。< / p >
我们的实验结果表明,NH4Cl NMDARs CPZ消除抑郁影响的活动。应该注意预处理的片NH4Cl并不影响之间的相互作用与谷氨酸网站NMDAR CPZ,因为最初的NMDAR激活减少但短期。然而,NH4Cl抑制激活末NMDARs CPZ引起的。测试的可逆性(临床意义上的,这意味着终止的行为CPZ神经元)。发现预处理的片NH4Cl导致NMDAR活动的完全恢复。这些发现表明抑制剂亲油性NH4Cl CPZ消除负面影响NMDAR和优化他们的功能。< / p >
提出了数据扩展理解一系列CPZ影响中枢神经系统。目前,主导思想是CPZ的影响主要体现在多巴胺和血清素激活的受体。然而,我们的数据表明,CPZ积极与ionotropic glutamatergic机制。注意glutamatergic系统是主要的中枢神经系统的兴奋性中介系统哺乳动物,包括人类。这些数据证明glutamatergic系统积极参与精神分裂症。我们相信数据提出了研究的影响在ionotropic CPZ glutamatergic机制允许了解伦敦的多方面的机制作用预防精神分裂症等精神疾病的恶化。< / p >
没有宣布。< / p >
作者感谢太太加林娜Smirnova为她优秀的技术援助。< / p >